mRNA轉(zhuǎn)染的優(yōu)勢(shì)

1. 高效且可控的表達(dá)：mRNA能迅速翻譯為蛋白質(zhì)，表達(dá)短暫且可控，降低過(guò)度表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)。
2. 細(xì)胞友好：mRNA引入細(xì)胞內(nèi)不易造成損傷。
3. 安全性與低免疫原性：mRNA不整合入宿主基因組，降低基因突變風(fēng)險(xiǎn)，降解產(chǎn)物為細(xì)胞自然成分。
4. 快速響應(yīng)與靈活性：mRNA快速合成能力使科學(xué)家能迅速調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案。

IVT的主要步驟

模板制備

• 以質(zhì)粒DNA為起點(diǎn)，通過(guò)瓊脂糖電泳鑒定質(zhì)粒。
• 選擇超螺旋狀態(tài)最佳的菌株，進(jìn)行線(xiàn)性化質(zhì)粒，選擇合適的限制性?xún)?nèi)切酶（如BsaI）進(jìn)行切割。

酶法加帽

• IVT后，使用牛痘病毒加帽酶和mRNA 2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶為mRNA加帽，增強(qiáng)穩(wěn)定性。

轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

• 準(zhǔn)備線(xiàn)性化質(zhì)粒模板，加入轉(zhuǎn)錄緩沖液、NTPs和RNA聚合酶，在37°C孵育合成大量mRNA。

純化

• 采用柱純化、磁珠純化或酚/氯仿純化等方法，去除雜質(zhì)，提取純凈的mRNA。

定量與檢測(cè)

• 使用紫外吸收法、染料法或毛細(xì)管電泳法對(duì)mRNA進(jìn)行定量和純度檢測(cè)。

共轉(zhuǎn)錄法加帽

• 為提高效率，可在IVT過(guò)程中直接加入帽子類(lèi)似物，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄與加帽同步進(jìn)行。

 IVT的主要試劑

轉(zhuǎn)染試劑選擇

ProteanFect

• 首·款基于蛋白遞送的轉(zhuǎn)染試劑，非常適合mRNA轉(zhuǎn)染。
• 在多種難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中效率顯著優(yōu)于lipofectamine。

ProteanFect在難轉(zhuǎn)細(xì)胞中的應(yīng)用

• 在Jurkat T細(xì)胞中，ProteanFect展現(xiàn)出對(duì)多種類(lèi)型核酸的高效遞送能力。